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掃描電鏡樣品制備的處理方法你知道么

文章來源:杰星科技 人氣: 發(fā)表時間:2021-01-05

  在進行掃描電鏡觀察前,要對樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是:盡可能使樣品的表面結(jié)構(gòu)保存好,沒有變形和污染,樣品干燥并且有良好導電性能。

  一、樣品的初步處理

  1、取材

  掃描電鏡來說,樣品可以稍大些,面積可達8mm×8mm,厚度可達5mm。對于掃描電鏡易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等,可固定在濾紙或卡片紙上,以充分暴露待觀察的組織表面。

  2、樣品的清洗

  用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面,即組織的游離面。由于樣品取自活體組織,其表面常有血液、組織液或粘液附著,這會遮蓋樣品的表面結(jié)構(gòu),影響觀察。因此,在樣品固定之前,要將這些附著物清洗干凈。

  3、固定

  固定所用的試劑和透射電鏡樣品制備相同,常用戊二醛及鋨酸雙固定。由于樣品體積較大,固定時間應(yīng)適當延長。也可用快速冷凍固定。

  4、脫水

  樣品經(jīng)漂洗后用逐級增高濃度的酒精或丙酮脫水,然后進入中間液,一般用醋酸異戊酯作中間液。

  二、樣品的干燥

  掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進行。無論是水或脫水溶液,在高真空中都會產(chǎn)生劇烈地汽化,不僅影響真空度、污染樣品,還會破壞樣品的微細結(jié)構(gòu)。因此,樣品在用電鏡觀察之前必須進行干燥。干燥的方法有以下幾種:

  1、空氣干燥法

  空氣干燥法又稱自然干燥法,就是將經(jīng)過脫水的樣品,讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。這種方法的優(yōu)點是簡便易行和節(jié)省時間;它的主要缺點是在干燥過程中,組織會由于脫水劑揮發(fā)時表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此,該方法一般只適用于表面較為堅硬的樣品。

  2、臨界點干燥法

  臨界點干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時,其表面張力等于零的特性,使樣品的液體完全汽化,并以氣體方式排掉,來達到完全干燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響,較好地保存樣品的微細結(jié)構(gòu)。此法操作較為方便,所用的時間也不算長,一般約2~3小時即可完成,所以是常用的干燥方法。

  3、冷凍干燥法

  冷凍干燥法是將經(jīng)過冷凍的樣品置于高真空中,通過升華除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冷凍干燥的基礎(chǔ)是冰從樣品中升華,即水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài),不經(jīng)過中間的液態(tài),不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用,從而減輕在干燥過程中對樣品的損傷。

  三、樣品的導電處理

  生物樣品經(jīng)過脫水、干燥處理后,其表面不帶電,導電性能也差。用掃描電鏡觀察時,當入射電子束打到樣品上,會在樣品表面產(chǎn)生電荷的積累,形成充電和放電效應(yīng),影響對圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進行導電處理,使樣品表面導電。常用的導電方法有以下幾種:

  1、金屬鍍膜法

  金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬,如金、鉑、鈀等蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜后,不僅可以防止充電、放電效應(yīng),還可以減少電子束對樣品的損傷作用,增加二次電子的產(chǎn)生率,獲得良好的圖象。

  2、組織導電法

  用金屬鍍膜法使樣品表面導電,需要特殊的設(shè)備,操作比較復雜,同時對樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足,有人采用組織導電法(又稱導電染色法),即利用某些金屬溶液對生物樣品中的蛋白質(zhì)?脂類和醣類等成分的結(jié)合作用,使樣品表面離子化或產(chǎn)生導電性能好的金屬鹽類化合物,從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導電率。

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